在剛剛過(guò)去的2015年，天昊生物參與解析了多個(gè)物種的線粒體&葉綠體基因組，這其中包括多個(gè)動(dòng)物物種的線粒體基因組（例如樹(shù)形拱肩網(wǎng)蛾，短角異斑腿蝗）和多個(gè)植物物種的葉綠體基因組（例如藥用植物盾葉薯蕷，樹(shù)參等；草本植物萬(wàn)年青，白掌，掌葉大黃；觀賞植物梳唇石斛）。這些工作不僅有助于獲得多個(gè)動(dòng)植物物種線粒體和葉綠體基因組序列，同時(shí)有助于進(jìn)行多個(gè)近源物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，并且可以為后續(xù)利用基因工程來(lái)改良作物的產(chǎn)量和重要化合物的含量提供理論依據(jù)。下面我們就由淺入深了解一下動(dòng)植物線粒體&葉綠體基因組測(cè)序的相關(guān)知識(shí)以及動(dòng)植物線粒體&葉綠體基因組測(cè)序經(jīng)典文章。
技術(shù)簡(jiǎn)介
真核生物有兩套遺傳體系，即核基因組和細(xì)胞器基因組，動(dòng)植物中的線粒體基因組，植物中的葉綠體基因組都是細(xì)胞器基因組。雖然線粒體和葉綠體有自己的遺傳物質(zhì)DNA及遺傳信息傳遞和表達(dá)系統(tǒng)（RNA、核糖體等），并且能合成自己的部分蛋白質(zhì)，但葉綠體和線粒體的蛋白質(zhì)有一部分是細(xì)胞核基因控制，在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上合成，所以線粒體和葉綠體是半自主性細(xì)胞器。線粒體與葉綠體都是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換的場(chǎng)所，線粒體是細(xì)胞中制造能量的細(xì)胞器，葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器。
總之，線粒體DNA（mtDNA）因其獨(dú)有的母系遺傳模式和較高的突變頻率， 已被廣泛用于生物進(jìn)化，群體結(jié)構(gòu)，疾病診斷，法醫(yī)等方面的研究。而葉綠體DNA（cpDNA）在揭示物種起源、生物進(jìn)化及不同物種之間的親緣關(guān)系等方面也具有很重要的作用。而二代測(cè)序可以簡(jiǎn)便快速、高通量獲得線粒體/葉綠體DNA 序列信息，因此在進(jìn)化生物學(xué)，疾病診斷和法醫(yī)上具有十分重要的意義。
測(cè)序方案
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測(cè)序方案 |
樣本要求 |
測(cè)序方式 |
數(shù)據(jù)要求 |
優(yōu)勢(shì) |
特點(diǎn) |
對(duì)Total DNA樣品進(jìn)行測(cè)序
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類(lèi)型：無(wú)降解，無(wú)污染的DNA
總量：>4μg
濃度：>50ng/μL；
純度：OD260/280=1.7-2.0 |
Hiseq 2×150 |
Q30>80%
2G data |
樣本要求低
實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單
實(shí)驗(yàn)周期短 |
適用于有參考基因組的物種，在分析環(huán)節(jié)可將核DNA剔除。 |
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對(duì)線粒體/葉綠體富集后的DNA樣品進(jìn)行測(cè)序 |
類(lèi)型：無(wú)降解，無(wú)污染的新鮮組織
總量：>1-5g
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Hiseq 2×150 |
Q30>80%
線粒體：20M data
葉綠體：300M data |
總數(shù)據(jù)量低
有效數(shù)據(jù)量高
分析難度低
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適用于目標(biāo)物種沒(méi)有參考基因組，在分析環(huán)節(jié)可降低難度。
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生物信息分析
線粒體生物信息分析
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• 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭序列及低質(zhì)量reads的處理
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• 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估
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• 將測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，去除核基因組序列
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• 線粒體基因組組裝拼接
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• 統(tǒng)計(jì)線粒體A/G/C/T 含量，AT 含量
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• 對(duì)線粒體基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋?zhuān)ǖ鞍拙幋a基因、編碼tRNA、rRNA 基因），包括基因大小、起始和終止密碼子分布統(tǒng)計(jì)
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• 通過(guò)和其它已測(cè)序物種的線粒體蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
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• 繪制線粒體基因組圈圖
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• 序列上傳
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• 其他個(gè)性化分析
葉綠體基因組信息分析
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• 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭序列及低質(zhì)量reads的處理
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• 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估
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• 將測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，去除核基因組序列
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• 葉綠體基因組組裝拼接
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• 分析葉綠體4 個(gè)特征區(qū)段（IRA 、IRB、LSC、SSC）
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• 統(tǒng)計(jì)葉綠體A/G/C/T 含量，AT 含量
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• 對(duì)葉綠體基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋?zhuān)ǖ鞍拙幋a基因、編碼tRNA、rRNA 基因）
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• 繪制葉綠體基因組圈圖
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• 通過(guò)和其它已測(cè)序的物種葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
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• 序列上傳
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• 其他個(gè)性化分析
文獻(xiàn)解析
文章1:中國(guó)地方性蝗蟲(chóng)牯嶺腹露蝗的線粒體全基因組測(cè)序
背景： 昆蟲(chóng)線粒體DNA（mtDNA）是一個(gè)典型的大小在14-18Kb，編碼37個(gè)基因的環(huán)型分子。最近，高通量測(cè)序已成為一種獲得線粒體基因組DNA的新方法，這種快速高效的技術(shù)不僅有利于線粒體基因組的系統(tǒng)構(gòu)建，也推動(dòng)了關(guān)于大量物種線粒體基因組文章的發(fā)表。牯嶺腹露蝗是最常見(jiàn)的，并廣泛分布在中國(guó)的一種地方性蝗蟲(chóng)，它能夠?qū)χ袊?guó)山毛櫸和玉米造成嚴(yán)重破壞，當(dāng)這兩種植物不足時(shí)，它也會(huì)危害高粱、小麥和大米。牯嶺腹露蝗的線粒體部分基因序列已被報(bào)到，但完整的線粒體基因組序列仍然沒(méi)有被公布。
目的：利用高通量測(cè)序技術(shù)分析牯嶺腹露蝗完整的線粒體基因組序列， 這將有助于補(bǔ)充蝗科昆蟲(chóng)完整線粒體基因組數(shù)據(jù)。
參考序列：北極翹尾蝗線粒體序列
結(jié)果：
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1. 發(fā)現(xiàn)牯嶺腹露蝗線粒體基因組大小為15,655bp，在大多數(shù)昆蟲(chóng)的大小范圍內(nèi)。
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2. 發(fā)現(xiàn)其核苷酸組成是不對(duì)稱(chēng)的(A: 42.8%, C: 14.2%, G: 10.5%，T:32.6%)，整個(gè)基因組的A+T含量為75.4%。
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3. 序列編碼37個(gè)典型基因（13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因）以及A+T富集區(qū)。
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4. 有11,193bp在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，1472bp在tRNA，1314bp在大rRNA，851bp在小rRNA，777bp在 A+T富集區(qū)域。
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5. 所有蛋白質(zhì)編碼基因以ATN作為起始密碼子，同時(shí)它們中的大多數(shù)也以TAA作為終止密碼子，但有兩個(gè)例外情況使用TAG作為終止密碼子（COX1和ND1）。
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6. 22個(gè) tRNAs大小在64-71bp，并且它們大多數(shù)在主鏈上。
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7. A+T富集區(qū)域位于小rRNA和tRNA-Ile之間，這個(gè)區(qū)域的GC含量為13.8%。
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8. 通過(guò)把測(cè)序數(shù)據(jù)中的COX1序列與先前報(bào)道的牯嶺腹露蝗COX1序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者有98.8%相似度，這表明測(cè)序得到的數(shù)據(jù)可以代表牯嶺腹露蝗的線粒體基因組序列。
參考文獻(xiàn)： Yang R, Guan L, Xu SQ. Complete mitochondrial genome of the Chinese endemic grasshopper Fruhstorferiola kulinga (Orthoptera: Acrididae: Podismini). Mitochondrial DNA. 2015, 29:1-2.
文章2：常綠植物樹(shù)參的葉綠體全基因組測(cè)序
背景：樹(shù)參是五加科常綠喬木或灌木物種，分布在中國(guó)，柬埔寨，老撾，泰國(guó)和越南。樹(shù)參因具有重要的藥用價(jià)值而廣泛地受到人們的關(guān)注。葉綠體因基因組小, 編碼區(qū)及非編碼區(qū)進(jìn)化速率的差異而越來(lái)越多地被用于系統(tǒng)發(fā)育研究；而且利用葉綠體基因工程來(lái)改良作物的產(chǎn)量及重要化合物的含量具有重要意義。
目的：利用高通量測(cè)序技術(shù)分析樹(shù)參的葉綠體基因組序列
參考序列：西伯利亞人參刺五加葉綠體序列
結(jié)果：
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1. 發(fā)現(xiàn)環(huán)形基因組的大小是156,687 bp。
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2. 包含一對(duì)反向重復(fù)序列（IR）（每個(gè)大小為25880 bp），一個(gè)大的單拷貝（LSC）區(qū)域（大小為86680 bp）和一個(gè)小的單拷貝（SSC）區(qū)域（大小為18247 bp）。
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3. 葉綠體基因組包含134個(gè)基因，其中89個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(81個(gè)PCG 類(lèi)型)，8個(gè)核糖體RNA基因(4個(gè)rRNA類(lèi)型)，和37個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 基因(30個(gè)tRNA類(lèi)型)。
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4. 在這些基因中， 16個(gè)基因有一個(gè)內(nèi)含子， 2個(gè)基因有一對(duì)內(nèi)含子。
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5. 絕大多數(shù)基因類(lèi)型有一個(gè)拷貝，而同時(shí)19個(gè)基因類(lèi)型有兩個(gè)拷貝。
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6. 所有這19個(gè)基因型包含所有的rRNA 類(lèi)型（4.5S, 5S, 16S，23S rRNA）, 7個(gè)tRNA 類(lèi)型（tRNA-Ala (UGC) , -Arg (ACG) ,-Asn (GUU) , -His (CAU) , -Ile (GAU) , -Leu (CAA) & -Val (GAC) ), 8個(gè)PCG類(lèi)型（ndhB, rpl2, rpl23, rps7, rps12, ycf1,ycf2, ycf15），并且這19個(gè)基因類(lèi)型都位于反向重復(fù)序列（IR）區(qū)域內(nèi)。
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7. 總的來(lái)說(shuō)，核苷酸組成是非對(duì)稱(chēng)的(30.7% A, 19.3% C, 18.7% G, 31.3% T)，整個(gè)基因組的A+T含量為62%， LSC，SSC和IR區(qū)域的A+T含量分別為63.8%, 68.0% and 56.9%。
參考文獻(xiàn)：Wang L, Du XJ, Li XF. The complete chloroplast genome sequence of the evergreen plant Dendropanax dentiger (Araliaceae). Mitochondrial DNA. 2015, 14:1-2.
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