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Q1:哪些樣品可以進行微生物多樣性檢測？ A:根據(jù)微生態(tài)的類型不同，擴增子測序檢測的樣品可以分為以下類型
Q2:擴增子測序目前可以分為哪幾種類型？ A:目前擴增子測序服務主要包括細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS1區(qū)/真菌ITS2區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)/功能微生物的功能基因測序，具體類型如下： 16S rDNA測序： 16S rRNA為核糖體的RNA的一個亞基，16S rDNA就是編碼該亞基的基因，存在于所有細菌基因組。16S rDNA大小適中，約1.5Kb左右， 16S rDNA具有10個保守區(qū)和9個高變區(qū) (V1-V9)， 其中保守區(qū)在細菌間差異不大， 高變區(qū)具有高度的特異性，因此可以通過對某個或某些高變區(qū)進行測序，從而對細菌菌落結構多樣性進行分析。 18S rDNA測序：18S rDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。在結構上分為保守區(qū)和高變區(qū)，保守區(qū)反映生物物種間的親緣關系，高變區(qū)反映物種間的差異，18S rDNA在進化速率上相對于ITS更加保守，一般在用于種以上的物種分類。 ITS 測序：在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA轉錄間隔序列稱為ITS區(qū)。ITS分為兩個區(qū)域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。ITS由于是非轉錄區(qū)，承受的選擇壓力較小，變異強，目前已廣泛用于種及種以下真菌分類鑒定。 功能微生物的功能基因測序：功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到廣泛關注的一類微生物，如硝化細菌、反硝化菌、氨氧化細菌、硫酸鹽還原菌、固氮菌、固氮菌等。每種功能微生物在分類學上可能有很大不同，但卻具有相類似的基因使其能夠發(fā)揮同樣的功能，因此使這些功能細菌發(fā)揮這種特定功能的基因就稱為功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。功能基因測序就是針對這些功能基因設計PCR通用引物，進行建庫高通量測序。 Q3:擴增子測序區(qū)段如何選擇？ A: 由于選擇不同的高變區(qū)，相同菌群的分類結果差別明顯，因此需根據(jù)文獻找到與您研究的微環(huán)境以及與您比較關注的菌群所用的區(qū)段，如果目前對其中菌群不是十分了解的話那么也盡量選擇類似環(huán)境，需要詳細查找文獻。
Q4: 擴增子測序是否需要設置生物學重復，如果需要多少合適？ A: 為了保證實驗結果的準確性，而且根據(jù)現(xiàn)已發(fā)表的文章，擴增子測序都需要設置生物學重復。如果是環(huán)境樣本建議最少3個生物學重復，例如某一地點的土壤樣品需要采集3份另外，實驗組和對照組的樣本重復數(shù)量和實驗條件需保持一致；如果是宿主樣本建議最少20個個體，例如糞便樣本，口咽樣本，唾液樣本都至少來自20個個體。
Q5: 收集樣本時為什么需要收集相關樣本信息？ A: 因為擴增子測序研究目的核心包括三方面的內容：研究樣品中的物種分類、物種豐度以及揭示環(huán)境因子和微生物群落結構之間的關系，因此收集樣本時有必要收集樣品的信息，例如醫(yī)學：性別、年齡、BMI、體重、是否服用抗生素、飲食習慣、疾病史、種族、地域等指標。農(nóng)業(yè)和環(huán)境：光照、溫度、濕度、離子濃度、PH、磷、有機碳、有機氮等指標。
Q6: 腸道微生物研究取樣有什么注意問題？ A: 假設您要對人體腸道微生物菌群進行測序，一般建議采取新鮮樣品，這是因為微生物本身是活的，樣品長期保存會改變原有菌群的構成；另外一般用無菌勺子取糞便中間，這是因為外層會與腸粘膜接觸，有人體脫落細胞污染；另外先排尿，避免尿液污染；另外如果寄送的是樣品而不是DNA，采樣后務必立即封存樣品冷凍保存，切忌反復凍融，送樣時使用干冰運輸，盡量縮短保存和運輸?shù)臅r間，謹防污染，盡可能地保持樣品中微生物的原始結構。
Q7:腸道微生物研究對象的篩選標準是什么？ A: 舉個鑒定與結直腸癌發(fā)生發(fā)展相關的腸道核心菌群的例子。 研究對象是：28份位置匹配的活檢標本，其中包括正常腸道組織樣本，腺瘤性息肉組織樣本，腫瘤組織樣本。 研究對象的篩選標準是： 正常組：所有志愿者無特殊飲食習慣；年齡在20-60歲之間；志愿者的健康狀況由自我報告和結腸鏡檢查來判斷；志愿者均無胃腸道疾病史，無肝、膽、膜腺等消化系統(tǒng)疾病史；無手術史而且在樣本采集3個月前沒有服用抗生素。 病例組：志愿者要接受問卷調查，調查內容包括年齡、性別、遺傳、飲食、藥物治療情況等。要求性別比例均衡；年齡階段盡可能一致，沒有吸煙、飲食不均衡等不良習慣；標本收集前3個月沒有使用過各種抗生素或益生菌；沒有２年以上醜酒史；不具有代謝性疾病，如肥胖癥、糖尿病、結石、各種肝病等；不具有家族聚集性疾病。
Q8:皮膚微生物研究對象的篩選標準是什么？ A: 舉個鑒定皮膚表皮不同部位真菌差異的例子。 研究對象：十位健康成年人身上收集了容易發(fā)生真菌性皮膚病的十四個皮膚部位拭子樣本。研究對象的篩選標準是：排除包括慢性皮膚疾病的對象；前6個月不使用抗菌藥物；洗澡可以被允許，但是僅能使用非抗菌肥皂或清潔劑；收集樣本24小時前沒有洗澡。
Q9:口腔微生物研究對象的篩選標準是什么？ A: 舉個鑒定牙周炎患者不同口腔環(huán)境的微生物群落組成的例子。 研究對象：牙周炎患者和健康志愿者的唾液，牙齦上菌斑，牙齦下菌斑樣本。 研究對象的篩選標準是：患者在樣本收集前的3個月內沒有接受牙周治療；所有參與者沒有懷孕或任何系統(tǒng)性疾??；在過去的3個月內沒有抗生素治療；至少20個牙齒在口腔內。所有參與者在采樣3小時前不要吃喝。
Q10:現(xiàn)在是個環(huán)境樣本就能進行微生物多樣性研究，但是怎么在前期實驗對象組合設計上更有新意？ A: 較早微生物多樣性研究的實驗對象組合只是簡單的病例/對照樣本，現(xiàn)在實驗對象組合上已經(jīng)向復雜的方向發(fā)展，通過下面的表格就一目了然了。 微生物多樣性與健康
微生物多樣性與環(huán)境
微生物多樣性與農(nóng)業(yè)
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