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英文題目：The impact and origin of copy number variations in the Oryza species 期刊名：BMC Genomics 發(fā)表日期: 2016年3月 研究背景： CNV, 也稱為不平衡結(jié)構(gòu)變異，包括大于50 bp 的缺失，插入和復(fù)制，它能夠改變基因結(jié)構(gòu)和基因劑量。CNV主要是由DNA重組，復(fù)制，損傷修復(fù)等過程中的錯誤造成的，關(guān)于CNV的形成機(jī)制目前主要是基于DNA雙鏈斷裂修復(fù)的研究。DNA雙鏈斷裂修復(fù)主要有兩種途徑：（1）非同源重組（NHR），它包括非同源末端連接（NHEJ）和微同源調(diào)節(jié)末端連接（MMEJ），它不依賴于序列同源性，只需要1–10 bp的微同源，（2）基于同源的修復(fù)，它包括非等位同源重組（NAHR）, 它需要數(shù)百個堿基的同源序列。通過檢測CNV區(qū)域和斷點的序列，還發(fā)現(xiàn)了其它的過程，例如移動元件插入（MEI）和數(shù)目可變的串聯(lián)序列重復(fù)（VNTRs）。 CNV對基因有顯著的影響，它能夠解釋很多表型變異，目前哺乳動物，果蠅中的很多研究闡述了CNV和表型變異之間的關(guān)系。在植物中，越來越多的證據(jù)表明CNV和重要表型相關(guān)聯(lián)，例如大豆Rhg1位點的CNV能夠調(diào)節(jié)對胞囊線蟲的抗性；玉米運輸?shù)鞍谆?em>MATE1的CNV與耐鋁性有關(guān)系；大豆硼轉(zhuǎn)運蛋白基因Bot1拷貝數(shù)增加可以增強(qiáng)對硼毒害的耐受性；水稻qPE9-1的缺失與穗直立性有關(guān)，而qsw5基因缺失能夠引起水稻顆粒尺寸的增加，GL7位點復(fù)制能夠引起水稻顆粒尺寸的多樣性。然而對植物CNV功能的探索才剛剛開始，最近幾項研究第一次從全基因組水平對植物CNV進(jìn)行了探索。在玉米中，CNVs廣泛存在于自交系中，并且它們富集于與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的位點。大豆，蠶豆，水稻，擬南芥，高粱，小麥，大麥基因組綜合分析表明受CNV影響的基因大部分是抗性基因和脅迫響應(yīng)基因。因為水稻品種的復(fù)雜性，明確的進(jìn)化關(guān)系，豐富的基因組資源使得其成為研究基因組進(jìn)化的一個良好模型。數(shù)個研究表明CNV廣泛存在于水稻不同品種中，然而關(guān)于CNV在水稻品種中的影響和起源還是未知的。 研究材料：已發(fā)表的50個水稻品種（40個栽培稻品種，10個野生稻品種）重測序數(shù)據(jù) 技術(shù)平臺：PCR； 研究思路： 下載50個水稻品種的重測序數(shù)據(jù)； 利用不同分析方法鑒定CNV； 鑒定進(jìn)化背景下的CNV類型； PCR驗證CNV數(shù)據(jù)集質(zhì)量； 比較不同研究結(jié)果的CNV數(shù)據(jù)集； CNV對基因的影響； GO分析CNV對基因功能的影響； PCR驗證已知功能基因的CNV ； 斷點特征推測非共線性CNV 基因的形成機(jī)制； 研究結(jié)果： 發(fā)現(xiàn)CNV 從NCBI上下載50個水稻品種（40個栽培稻品種，10個野生稻品種）的重測序數(shù)據(jù)，采用3種相互補(bǔ)充的方法（（PE, RD, SR）來鑒定水稻品種中的CNV，為了獲得可信CNV，綜合了不同CNV軟件（BreakDancer, CNVnator，Pindel）的結(jié)果，方法流程請見Fig. 1。最初關(guān)注的是缺失，通過和日本晴參考基因比對總共檢測到9196個缺失（62 -654,630 bp）（平均 4,166 bp）。98 %的缺失（9,015 of 9,196）被推斷出斷點。為了在進(jìn)化背景下確定這些CNV是缺失還是插入，使用非洲栽培稻作為外群，通過和非洲栽培稻的同源區(qū)域進(jìn)行比較，重新確定了這些CNV的變異類型：在8,929個缺失事件中，7,400個實際上是插入，1,526個是真正的缺失。 
Fig. 1 使用NGS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)CNV。 a CNV發(fā)現(xiàn)和鑒定的流程圖。b 通過分析方法PE （紅色） 和RD （深灰色高峰）發(fā)現(xiàn)一個CNV的示例。淡灰色方框代表pair-end reads。25901_TRJ和11010_TRJ 分別是含有和不含有CNV的兩個水稻品種。
CNV驗證為了評估CNV數(shù)據(jù)集的質(zhì)量，對5個隨機(jī)水稻品種的90個候選CNV進(jìn)行了PCR驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)76.7 % （69/90） 的 CNV得到驗證，并且把這個數(shù)據(jù)集和最近報道的CNV數(shù)據(jù)集通過RD方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個數(shù)據(jù)集有68%（6,210 個事件）重疊。接著通過和粳稻，秈稻的芯片數(shù)據(jù)以及水稻和其它3個近源物種BAC數(shù)據(jù)比較來評估這個數(shù)據(jù)集，結(jié)果只有80個事件，3個事件分別和芯片數(shù)據(jù)，BAC數(shù)據(jù)重疊，這可能是因為不同方法檢測到的大小范圍不同最終造成重疊較小，以前報道的CNV主要集中在大片段事件，而這次數(shù)據(jù)則主要是中等大小的CNV，大約有87%（7,986/9,196）的CNV小于10 kb。 CNV對基因的影響 接著分析了CNV對基因的影響，總計有2,806個基因被2,879個CNV影響，1,675個基因的編碼區(qū)被CNV打斷，造成558個部分基因缺失，1,117個整體基因缺失 （Table 1）。接著對影響1117個整體基因缺失的720個 CNV的群體分布進(jìn)行了分析。約81.7 %的CNV被栽培稻和野生稻共享， 0.8 %的CNV只在野生稻中存在，17.5 %的CNV只在栽培稻中存在。接著分析了CNV在水稻亞種（粳稻，秈稻）中的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約12.9 %的CNV被粳稻和秈稻共享，0.7 %的CNV只在秈稻中存在，3.9 %的CNV只在粳稻中存在。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分CNV被栽培稻和野生稻或者粳稻和秈稻所共享，這說明大部分的CNV來自相同的基因池。  接著分析了CNV對基因功能的影響，對上述1,675 個CNV基因進(jìn)行了GO功能分析，發(fā)現(xiàn)它們富集于與環(huán)境的互作，例如脅迫反應(yīng)，過敏反應(yīng)等，而受CNV影響的1117個整體基因則富集于細(xì)胞凋亡過程。 驗證已知功能基因的CNV 接著驗證了一些以前描述過的被CNV打斷的功能基因。 OsMADS56編碼一個MIKC類型MADS-box蛋白，它包含8個外顯子，過表達(dá)它能夠造成開花延遲，而功能缺失突變則不影響開花時間?？缭?em>OsMADS56第一個外顯子的一個CNV能夠造成MADS-box結(jié)構(gòu)域的部分缺失（Fig. 2a）。 BPH14能造成對水稻褐飛虱產(chǎn)生抗性，它編碼一個CC-NB-LRR蛋白。使用PCR能夠檢測到橫跨整個BPH14基因的一個CNV （Fig. 2b）。 OsDCL2b （LOC_Os09g14610）是一個Dicer-like基因, 主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，一個65 kb包含OsDCL2b的CNV被鑒定到。序列比對發(fā)現(xiàn)它存在于O. sativa，但不存在于Oryza nivara, Oryza barthii, Oryza glumaepatula, Oryza meridionalis, Oryza punctata, 暗示著這個CNV實際上是存在于O. sativa的一個插入。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)OsDCL2b實際上是OsDCL2a的復(fù)制，這個復(fù)制是從3號染色體到9號染色體的一個大片段復(fù)制的一部分（Fig. 3a）。 OsMADS30 （LOC_Os06g45650）編碼一個MIKC類型MADS-box蛋白，它主要參與脫水和鹽脅迫反應(yīng)。一個橫跨OsMADS30至少兩個外顯子的CNV被鑒定到。序列比對分析發(fā)現(xiàn)這個CNV只存在于O. sativa，預(yù)示它是進(jìn)化過程中的一個最新插入，這個片段主要從同一個染色體上囊括LOC_Os06g40609的一個基因組區(qū)域復(fù)制而來（Fig. 3b），因此OsMADS30實際上是O. sativa中由于基因融合而產(chǎn)生的一個新基因。 
Fig. 2 使用PCR在18個水稻品種中對基因OsMADS56和BPH14的CNV進(jìn)行驗證。a OsMADS56的基因結(jié)構(gòu)和CNV位置。 b BPH14的基因結(jié)構(gòu)和CNV位置。 藍(lán)色框代表CDS；白框代表UTR；紅色三角代表CNV的位置。
 
Fig. 3 PCR 驗證OsDCL2b和OsMADS30中的CNV。 a OsDCL2b（紅色）實際上是OsDCL2a（藍(lán)色）的復(fù)制，這個復(fù)制是從3號染色體到9號染色體的一個大片段復(fù)制的一部分。 b這個片段主要從同一個染色體上囊括LOC_Os06g40609的一個基因組區(qū)域復(fù)制而來?；疑乃骄€代表水稻的同源區(qū)域；綠線代表CNVs；黃線代表CNV的同源區(qū)域；灰色豎線代表基因；灰盒代表外顯子。直系同源使用紅線連接，同源基因使用藍(lán)線連接。
非共線性CNV 基因的形成機(jī)制許多CNV基因?qū)嶋H上是因為插入進(jìn)而形成了非共線性基因。通過和O. glaberrima比對在編碼區(qū)受CNV影響的697個基因中，有287個是非共線性基因，而這287個基因的大部分（260/287）在O. sativa都有同源基因（同源性80 %-100 %），暗示著這些非共線性基因可能是從基因組的其它地方復(fù)制而來（Fig. 4）。 
Fig. 4 序列分析非共線性CNV基因的起源。包含非共線性CNV基因的區(qū)域用來和O. glaberrima 的同源區(qū)域進(jìn)行比對。a 非共線性CNV基因 LOC_Os05g33910 是LOC_Os12g06050的一個復(fù)制。 b 一個包含LOC_Os05g03810 的CNV是從一個橫跨LOC_Os12g32130的片段復(fù)制而來。
把非共線性基因與它們對應(yīng)的祖先基因進(jìn)行比對，通過斷點特征來推測非共線性基因的形成機(jī)制。非共線性基因兩端的轉(zhuǎn)座元件預(yù)示著這些復(fù)制事件可能被轉(zhuǎn)座元件的活性所調(diào)控（Fig. 5a）。非共線性基因與它們對應(yīng)的祖先基因之間斷點處的微同源性和無同源性預(yù)示NHEJ可能在DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中起作用（Fig. 5b）。斷點處的高同源性支持NAHR在起作用（Fig. 5c）。共計有12個轉(zhuǎn)座元件形成的事件，14個由NHEJ形成的事件，1個NAHR形成的事件。
Fig. 5通過斷點特征推斷非共線性CNV基因形成機(jī)制。a 與祖先基因Os01g10210比較， Mutator-like元件分布在Os12g34770的兩側(cè), 暗示這個復(fù)制事件受轉(zhuǎn)座元件調(diào)控。b 非共線性基因Os06g40650與祖先基因Os06g40609之間斷點處的微同源性暗示在DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中受NHEJ調(diào)節(jié)。c High homology at breakpoint between 非共線性基因Os11g17120 和祖先基因Os11g17330之間斷點處的高同源性暗示受NAHR調(diào)節(jié)。黑框代表基因;綠框代表Mutator-like元件；紅字代表非共線性基因與祖先基因的同源序列。
接著運用BreakSeq方法來確定整個CNV數(shù)據(jù)集的形成機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)52.98 %和44.28 %的CNV分別由NHR和MEI形成；0.48 %和0.29的CNV分別由NAHR和VNTR形成（Fig. 6a-c）。通過把CNV大小和形成機(jī)制關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)在MEI, NAHR, NHR形成較大的CNV，而VNTR形成相對小的CNV （Fig. 6d）。
Fig. 6 水稻基因組的CNV形成機(jī)制分布。a 9015個CNV的不同形成機(jī)制分布。外面的環(huán)代表每種機(jī)制形成的CNV數(shù)目。 內(nèi)環(huán)代表這些機(jī)制在基因組上的大小累計。 b, c Spatial distribution of 在12條染色體上由不同機(jī)制形成的CNV空間分布。d 由不同機(jī)制形成的CNV大小比較。
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